目前人胰岛素是通过基因工程生产的,其纯度高、副作用少,利用大肠杆菌可实现人胰岛素的大规模生产。已知限制性核酸内切酶BamHI与MboI的识别序列和切割位点分别为-G↓GATCC-和-↓GATC-,图1为目的基因与pBR322质粒形成重组质粒的2种情况,图2为抗药性筛选流程。(注:BamHI、Pst I、MboI为限制酶,ori为复制原点,Amp为氨苄青霉素抗性基因,Tet为四环素抗性基因。上标“r”代表抗性;“s”代表敏感)。

(1)获取人的胰岛素基因时,先从胰岛B细胞获取胰岛素基因的mRNA,再通过
_________过程获得cDNA,此方法获得的基因与细胞内的胰岛素基因相比在结构上缺少
_________等序列。
(2)通过上述方法获得人的胰岛素基因后,需要通过PCR技术进行扩增。实时荧光定量PCR(qPCR)实现了PCR从定性到定量的飞跃。TaqMan探针是qPCR技术中一种常用探针,下图3为TaqMan荧光探针及其作用原理示意图。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时该探针能被Taq酶切割降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增1个DNA分子,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为a,加入b个模板DNA分子(目的基因),通过qPCR进行扩增。反应体系中荧光信号强度(Rn)与扩增次数(n)之间的关系为:Rn=
_________。

(3)据图1中的信息,若胰岛素基因与质粒分别使用MboI和BamHI不同的限制酶切开,插在质粒pBR322的BamHI位点处,在形成重组质粒之后,再重新切下目的基因最好使用
_________酶;用限制酶BamHI处理质粒pBR322后得到的分子中共有
_________个游离的磷酸基团。
(4)抗药性筛选法实施的前提条件是载体DNA携带抗生素的抗性基因。如果采用图2抗药性筛选流程,则可筛选出的含重组质粒的大肠杆菌的表现型是
_________。
(5)除抗药性筛选法外,显色筛选也是常用的方法。很多大肠杆菌的质粒上含有lacZ'标记基因(图4中甲),其表达的酶蛋白可将一种无色的化合物(X—gal)水解成蓝色产物。若重组DNA技术常用的大肠杆菌质粒pUC18同时携带Amp'和LacZ'两个标记基因,据图4分析,若想筛选出重组质粒,配制的固体培养基的成分中,除营养物质和琼脂外还需含有
_________,经转化、扩增、涂布,图4乙中含重组质粒的是
_________(白色/蓝色)菌落。
(6)某研究人员测定受体大肠杆菌的某段基因序列,经测定其蛋白质编码序列(即编码从起始密码子到终止密码子之间的序列)为3002对碱基,请判断对这段序列的测定
_________(选填“是”或“否”)存在错误。