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PCR技术是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，其最大的特点是能将微量的DNA大幅增加。
I.如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图1（以EcoRI酶切为例）所示。
(1)步骤Ⅱ中所用的DNA连接酶的作用是催化形成____________，从而形成环状DNA。
(2)步骤Ⅲ中的复性温度设定是成败的关键，温度过高会破坏______________________的碱基配对。

(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是__________（填数字“①、②、③、④”）。

	DNA序列（虚线处省略了部分核苷酸序列）
已知序列
PCR引物	①5′-AACTATGCGCTCATGA-3′   ②5′-AGAGGCTACGCATTGC-3′ ③5′-GCAATGCGTAGCCTCT-3′   ④5′-TCATGAGCGCATAGTT-3′

(4)新冠病毒核酸定性检测原理：先以病毒RNA为模板利用__________酶合成cDNA，再通过PCR技术扩增相应的DNA片段，然后在扩增产物中加入特异的核酸探针。如果检测到特异的杂交分子则核酸检测为阳性。此方法为RT-PCR技术。
(5)如果探针是带有荧光标记的，即为“实时荧光RT-PCR技术”。在PCR反应体系中，加入的荧光探针与模板DNA的某条链互补结合，探针完整时，报告荧光基团发射的荧光信号被淬灭荧光基团吸收。当子链延伸至探针处，探针被TaqDNA聚合酶降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而发出荧光（如图2所示）。即每扩增1个DNA分子，就有1个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。

①若最初该反应体系中只有1个DNA分子模板，进行第4次循环时，需要消耗荧光探针____________个。
②检测时，荧光强度一般要达到或超过阈值才能确诊。若检测出现假阴性，推测可能的一个原因__________________________________。